免疫親和純化的操作步驟

    純化率為1000～10 000倍。

    快速純化抗原，層析柱常可重復(fù)使用。

    可獲得純化的抗原。

    不能用于定量測(cè)定。

    純化效果取決于抗原的濃度和抗體的親和力

    需要適當(dāng)純化的抗體。

 

    2．操作步驟

    (1)將抗體結(jié)合到蛋白A或蛋白G微珠上。對(duì)于一般用途的層析柱，每毫升濕的微珠大約可以結(jié)合2mg單克隆抗體或親和純化的多克隆抗體。將抗體和蛋白A或蛋白G微珠混合制成稀薄的勻漿，在總量為10ml的溶液中加入大約lml微珠，室溫孵育1h，輕輕搖動(dòng)混勻。

    (2)用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉(pH9．0)洗滌微珠2次，每次以3000g離心2rain或10 000g離心30s。  

    (3)用10倍體積的0．2mol／L硼酸鈉(pH9．0)重懸微珠，留取相當(dāng)于10t~l濕微珠的樣品。加入足量的二甲基庚二酸酯(固體)至微珠勻漿中，使終濃度為20mmol／L。

    (4)室溫孵育30min，并輕輕混勻。留取相當(dāng)于10t~l偶聯(lián)微珠的樣品。

    (5)用0．2mol／L乙醇胺(pH8．0)洗滌微珠1次以終止反應(yīng)。然后重懸于0。2mol／L乙醇胺，室溫孵育2h，輕輕混勻。微珠用PBS洗滌后，重懸于PBS，加入硫柳汞保存。

    (6)將偶聯(lián)前和偶聯(lián)后的微珠樣品加入Laemmli樣品緩沖液中煮沸后，檢查偶聯(lián)效果。分別取相當(dāng)于1ul和9ul 2份樣品在10％SDS—聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并用考馬斯亮藍(lán)染色，偶聯(lián)效果良好時(shí)，在偶聯(lián)前的微珠樣品中顯示一條55kDa的重鏈帶，而偶聯(lián)后的樣品無(wú)此區(qū)帶。

    (7)將抗體包被的微珠轉(zhuǎn)入合適的層析柱中，用PBS沖洗容器，收集殘留的微珠。如果可能，僅使用結(jié)合制品中全部抗原所需的抗體微珠基質(zhì)。

    (8)用20倍柱床體積與制備抗原相同的緩沖液洗柱。

    (9)將抗原液加到柱上，按每毫升柱體積大約lml／h的速度使抗原溶液流過(guò)層析柱，可以用一臺(tái)蠕動(dòng)泵控制。

    (10)用20倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(PBS)洗柱。

    (11)用20倍柱床體積的預(yù)洗脫緩沖液洗柱。建議使用預(yù)洗脫緩沖液。

    (12)采用分段洗脫法，連續(xù)以0．5倍柱床體積的洗脫緩沖液通過(guò)層析柱，分管收集每一組分。如果用過(guò)高或過(guò)低pH值的緩沖液洗脫，收集管內(nèi)需加入0。1倍柱床體積的緩沖液

    (13)檢測(cè)每管的抗原含量，將濃度高的各管合并。根據(jù)抗原的用途，需對(duì)獲得的蛋白洗脫液透析以改變緩沖液。

    (14)用20倍柱床體積的起始緩沖液流經(jīng)基質(zhì)，使層析柱再生。加入0．01％硫柳汞可長(zhǎng)期保存(4℃)。

---