藥敏實驗方法

                                      藥敏實驗方法

1.實驗材料：

1.1培養基：如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥康凱培養基，做沙門氏菌可選擇SS培養基，巴氏桿菌可選擇血液瓊脂。

1.2藥敏試紙：購買、自制或廠家提供

1.3細菌：從病雞病變部位提取，如肝臟、心臟、脾臟等臟器。

1.4接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯

1.5移液器、滴頭

2.實驗準備：

2.1藥敏片的準備：自制

2.1.1藥敏片的制備：取定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片，取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎，經15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使*干燥。

2.2.2抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液適量，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內過夜，干燥后即密封，切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3-6個月。

2.2藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥治療量3-5倍比例配制藥液；如治療量為1L水加1g藥，配制藥液時就是1g加200-300ml水或1L水加3-5g藥，及配制藥敏片所用的藥液。

3.實驗操作方法：

3.1藥敏片法

3.1.1在“超凈臺”（或自制無菌操作臺）中，用（酒精燈）經火焰滅菌的接種環從病料中挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養基上。具體方式：用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2，然后找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可將待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，將少量混懸液倒入平皿培養基上，輕晃平皿使鋪勻，放置5-10min）。

3.1.2將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養基表面。為了使藥敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準確的觀察結果，要求藥敏片能有規律的分布于平皿培養基上，一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼4-5片），每種藥敏片的名稱要記住。

3.1.3將平皿培養基倒置放于37℃溫箱中培養24小時后，觀察效果。

4.結果觀察：

在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

5.判定標準：

5.1藥敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

  表1  藥物敏感實驗判定標準

5.2 藥物敏感實驗判定標準參考表1，抑菌圈直徑在15毫米以上為高敏，10毫米以下為低敏，無抑菌圈為不敏。

6.影響藥敏結果的因素：

6.1培養基：應根據試驗菌的營養需要進行配制。傾注平板時，厚度合適（約5-6mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基18-20ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌藥物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺藥和TMP的活性。

6.2細菌接種量：細菌接種量應恒定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞藥物的抗菌活性。

6.3藥物濃度：藥物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需配制。

6.4培養時間：一般培養溫度和時間為37℃、12-24小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養基，先置4℃冰箱內2-4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。

7.應用

藥敏實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協助使用，以減少耐藥菌株。選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為我們藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。

附表2  山東省2004年1-5月份大腸桿菌和沙門氏菌常用藥物敏感程度參考表