TeloTAGGG™ 端粒長度檢測試劑盒

端粒是位于真核細胞染色體末端的特殊DNA蛋白結構，由小串聯重復DNA序列組成。已有許多端粒序列經過鑒定，顯示其具有非常少的序列變異，甚至是在系統發育存在差異的生物體之間，如四膜蟲（序列：TTGGGG)和人類（序列：TTAGGG)。
由于DNA聚合酶不能復制線性DNA的末端，因此，有人認為每個復制周期都會導致染色體末端逐漸縮短（稱為“末端復制問題"）。已在體外和體內經過證實的這種現象，似乎與正常體細胞的有限增殖能力（“有絲分裂鐘"）有關。由于生殖細胞、干細胞和腫瘤細胞都表現出具有延長甚至無限的壽命，因此有人提出這些細胞必須具有維持端粒長度的特定機制。
保持穩定的端粒長度與端粒酶的激活有關。該酶是一種核糖核蛋白，利用其內在RNA組分作為DNA合成的模板，通過在染色體末端添加重復序列來補償端粒DNA的丟失。
端粒通過與結構蛋白發生特異性結合，對維持真核細胞內染色體的穩定性具有重要作用。這些蛋白質可以封閉線性染色體的末端，防止核降解、染色體末端融合、不規則重組以及其他通常對細胞致命的事件。
對人類外周血單核細胞研究樣本中端粒長度的分析揭示了端粒長度隨供體年齡的增加而降低，反映了這些細胞的復制史。已在多種疾病（如，唐氏綜合征、共濟失調性毛細血管擴張和HIV感染）中發現存在端粒丟失加速的現象，表明端粒長度縮短可能與這些疾病相關的免疫功能障礙有關。該試劑盒用于進一步了解關于這些關系的科學知識。

分析時間：約18小時
樣品材料：細胞培養物和其他生物樣品

用于測定端粒長度的非放射性化學發光檢測法。

該試劑盒對末端限制性片段（TRF）進行Southern分析，這些片段是利用頻繁切割限制性內切酶消化基因組DNA而獲得的。
第1步：基因組DNA的消化
使用優化的頻繁切割限制性內切酶混合物消化純化的基因組DNA。選擇的酶不會切割端粒DNA和亞端粒DNA。這是因為重復序列具有特殊序列特征。非端粒DNA被消化成低分子量片段。
第2步：凝膠電泳和Southern印跡
在DNA消化后，通過凝膠電泳分離DNA片段，然后通過Southern印跡將其轉印至尼龍膜上。
第3步：雜交和化學發光檢測
轉印的DNA片段與端粒重復序列的特異性DIG標記探針雜交，然后使用與堿性磷酸酶共價連接的DIG特異性抗體孵育。最后，使用堿性磷酸酶的高靈敏度化學發光底物CDP-Star，使固定的端粒探針顯色。通過對比信號與分子量標準品，可確定平均TRF長度。

TeloTAGGG^™ Telomere Length Assay被設計用于以下生命科學研究應用:

• 靈敏檢測細胞培養物和其他生物研究樣品中的端粒DNA（端粒序列：TTAGGG)[1]

• 檢測細胞培養物和其他生物研究樣品中DNA的端粒長度[2][3][4]

1個試劑盒包含15種組分。

探針的序列和長度保密。試劑盒中的DIG標記MW是DIG MW III和VII的混合物

工作濃度：結合物的工作濃度取決于應用和底物

以下濃度應作為使用指南：

• 斑點雜交印跡：100 ng/ml

• ELISA：100 ng/ml

• 蛋白質免疫印跡：100 ng/ml

工作濃度：TAE緩沖液
0.04 M Tris-乙酸，0.001 M EDTA，pH 8.0
HCl溶液
0.25 M HCl
一個200 cm² 的印跡需要約250 ml溶液。
變性 溶液
0.5 M NaOH，1.5 M NaCl
一個200 cm² 印跡需要約500 ml溶液。
中和液
0.5 M Tris-HCl,3 M NaCl,pH 7.5
一個200 cm² 印跡需要約500 ml溶液。
20x SSC
3 M NaCl,0.3 M檸檬酸鈉,pH 7.0
2x SSC
使用經高壓滅菌的重蒸水稀釋20x SSC(溶液5)，稀釋比例為1:10。
DIG Easy Hyb雜交顆粒
使用64 ml經高壓滅菌的重蒸水重懸顆粒（瓶8），并在37 °C孵育至全重懸。臨用前幾小時制備溶液。
嚴格洗滌緩沖液I
2x SSC，0.1% SDS
嚴格洗滌緩沖液II
0.2x SSC，0.1% SDS
洗滌緩沖液，1x
使用經高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的洗滌緩沖液10倍濃縮液（瓶10），稀釋比例為1:10。
封閉液，1x
使用1x馬來酸緩沖液（溶液12）稀釋適量的封閉液10倍濃縮液（瓶12），稀釋比例為1:10。
馬來酸緩沖液，1×
使用經高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的馬來酸緩沖液10倍濃縮液（瓶11），稀釋比例為1:10。
DIG-AP抗體，工作溶液
為減少聚集抗體產生的背景，請在使用前將試劑瓶以13,000 rpm離心5分鐘。
使用1x封閉液（溶液11）將適量DIG-AP抗體（瓶13）溶液稀釋至終濃度為75 mU/ml (1:10,000)。
檢測液，1x
使用經高壓滅菌的重蒸水稀釋適量的檢測液10倍濃縮液（瓶14），稀釋比例為1:10。
儲存條件（工作溶液）：TAE緩沖液：
在15至25 °C下穩定保存
HCl溶液
在15至25 °C下穩定保存
變性 溶液
在15至25 °C下穩定保存
中和液
在15至25 °C下穩定保存
20x SSC
在15至25 °C下穩定保存
2x SSC
在15至25 °C下穩定保存
DIG Easy Hyb雜交顆粒
在15至25 °C下穩定保存3個月
嚴格洗滌緩沖液I
在15至25 °C下穩定保存
嚴格洗滌緩沖液II
在15至25 °C下穩定保存
洗滌緩沖液，1x
在15至25 °C下穩定保存
封閉液，1x
臨用前配制。請勿儲存
馬來酸緩沖液，1×
在15至25°C下穩定保存。
DIG-AP抗體，工作溶液
臨用前配制。請勿儲存
檢測液，1x
在15至25°C下穩定保存